ه‍.ش. ۱۳۹۴ بهمن ۲۴, شنبه

مروری بر روش‌های مطالعه شناخت

از: دکتر محمدرضا ابوالقاسمی دهاقانی)

از عصب تا ذهن

مروری بر روش‌های مطالعه شناخت


فهرست مندرجات

.



مروری بر روش‌های مطالعه شناخت

قسمت دوم


 

دانش ، دانش مطالعه‌ی ذهن، رفتار و مغز است. در سال‌های اخیر روش‌های بسیار زیادی جهت مطالعه علمی دانش شناخت ارائه شده است. در این مقاله، محمدرضا ابوالقاسمی دهاقانی، دارنده‌ی دکترای علوم اعصاب شناختی و محقق پژوهشگاه دانش‌های بنيادی، در دو قسمت که در شماره‌های پیاپی ٦٠٢ و ٦٠٣ به نشر رسیده است، به معرفی اجمالی این روش‌ها می‌پردازد.

روش‌های مطالعه یک دانش، نقش بسیار مهمی را در پیشرفت علوم بازی می‌کنند. در بسیاری از مواقع کشف یک روش جدید دریچه‌ی جدیدی برای توسعه‌ی آن علم باز می‌کند. برای نمونه کشف تلسکوپ را برای علم نجوم در نظر بگیرید. بسیاری از ایده‌ها و نوآوری‌های علم نجوم به‌وسیله تلسکوپ معنا پیدا می‌کند. به همین ترتیب، روش‌های تکثیر و خالص‌سازی ژن‌ها در علم ژنتیک، نقش بسیار مهمی را ایفا می‌کنند. توجه به این نکته ضروری است که حتی قوی‌ترین روش‌ها به تنهایی نمی‌تواند توسعه‌ای در علم انجام دهند. وجود سئوال مشخص و دقیق در کنار علم است که می‌تواند برای پیشبرد علوم راهگشا باشد.

به دلیل ماهیت بین رشته‌ای علوم شناختی، روش‌های آن نیز معمولاً از ترکیب و ایجاد رابطه بین روش‌های علوم تشکیل‌دهنده دانش شناخت به‌وجود می‌آید. برای نمونه روش‌های تصویربرداری کابردی از مغز با روش‌های روان‌شناسانه ترکیب شده و روشی جدید برای مطالعه رابطه بین مغز و رفتار به‌وجود آورده است. با این مقدمه به سراغ روش‌های مطالعه دانش شناخت می‌رویم.

٣فرآیندهای ثبت فعالیت‌های الکتریکی یک سلول عصبی

در قسمت اول از سایکوفیزیک و مدل‌های رایانه‌ای به‌عنوان دو نمونه از روش‌های مطالعه شناخت نام بردیم. در سایکوفیزیک به‌دنبال یافتن رابطه‌ی بین ادراک از دنیای درون و محرک کمی‌شده از دنیای بیرون هستیم. مدل‌های رایانه‌ای به ما کمک می‌کنند تا سازوکار فرآیندهای شناختی را بهتر بشناسیم و از طرف دیگر فرآیندهای شناختی مسیر بهبود مدل‌های رایانه‌ای هوشمند را تسریع می‌کنند.

همان‌طور که قبلاً گفته شد، دانشمندان علوم اعصاب شناختی در صدد کشف و توصیف فعالیت‌های عصبی هستند که همزمان با فعالیت شناختی در مغز و سیستم اعصاب مرکزی انجام می‌شود. فرآیند ثبت فعالیت‌های عصبی روش‌های متفاوتی دارد که در این شماره به بخشی از آن‌ها می‌پردازیم. روش‌های بیان شده در این قسمت به فعالیت‌های الکتریکی نورون‌هابه صورت تک‌سلولی بر می‌گردد.

  • فعالیت‌های الکتریکی سلول‌های عصبی:

مغز و سیستم اعصاب مرکزی موجودات زنده از واحد‌های کوچکی به‌نام نورون (سلول عصبی) تشکیل شده است (شکل ۱). هر نورون شامل قسمت‌هایی است که به کمک آن پیام عصبی را انتقال می‌دهد. شکل ٢ نمایی از یک نورون را نمایش می‌دهد. در قسمت سر هر نورون جسم سلولی قرار گرفته است. دندریت‌ها به‌عنوان ورودی‌های سلول عصبی به بدنه‌ی جسم سلولی متصل‌اند و هسته سلول‌عصبی که حاوی اطلاعات ژنتیکی سلول است درون جسم سلولی قرار دارد. پیام عصبی که یک سیگنال الکتریکی است از مسیر آکسون که توسط یک گلوگاه به‌جسم سلولی متصل است، عبور کرده و به پایانه‌های آکسونی می‌رسد. این مسیر با غلاف‌های میلین پوشیده شده تا سرعت عبور سیگنال‌های عصبی را ده‌ها برابر افزایش دهد.

شکل ۱ - نمایی از مغز انسان و نمایش یک نورون به‌عنوان واحد سازنده سیستم عصبی

محیط داخل و خارج هر سلول عصبی سرشار از یون‌های حاوی بار الکتریکی است. این یون‌ها از گذرگاه‌های فراوانی که سطح نورون‌ها را پوشانده ‌است، بین محیط داخل و خارج سلول در حال انتقال هستند. این گذرگاه‌ها به‌عنوان کانال یونی شناخته می‌شوند. کانال‌های یونی انواع فراوانی دارند. بسیاری از آن‌ها فقط به یون‌های مشخصی (مثلاً یون سدیم Na+ یا پتاسیم K+) اجازه عبور می‌دهند. عده‌ای دیگر از این کانال‌ها نه تنها به‌نوع یون عبوری حساس هستند بلکه تنها در شرایط خاصی باز می‌شوند. برای مثال بسیاری از کانال‌های سطح نورون تنها در محدوده‌ی ولتاژی خاصی باز می‌شوند (به‌عنوان مثال کانال‌های حساس به ولتاژ سدیم و یا پتاسیم). این ویژگی‌های منحصر به‌فرد به‌سبب ساختار پروتئینی ویژه کانال‌ها حاصل می‌شود. وجود این منافذ پیچیده (کانال‌های یونی) بر روی سطح سلول عصبی موجب می‌شود تا محیط داخل و خارج سلول از نظر مجموع بار یونی یکسان نباشند. عدم تعادل بار یونی در محیط داخل و خارج سلول باعث ایجاد اختلاف پتانسیل در دو طرف دیواره سلولی (غشأ) می‌شود. در حالتی که هیچ تحریک خارجی وجود ندارد (حالت استراحت) اختلاف پتانسیل مشخصی در اطراف غشای سلولی برقرار است (پتاسیل استراحت). هرگاه این اختلاف پتانسیل به‌گونه‌ای بر هم بخورد که وضعیت کانال‌های یونی حساس به ولتاژ عوض شود، نورون وارد حالت‌های الکتریکی جدیدی می‌شود.

شکل ٢ - طرح کلی از نورون و اجزای سازنده آن.

تحریک‌های کوچکی از طریق محیط بیرون و یا سلول‌های عصبی دیگر به نورون مقصد اعمال می‌شود. هر کدام از این تحریک‌ها به اختلاف پتاسیل‌های کوچک مثبت و منفی در اطراف غشای سلول تبدیل می‌شود. اگر این اختلاف پتانسیل‌های کوچک، در زمان و مکان‌های مناسبی اعمال شوند می‌توانند با رسیدن به حد آستانه و برهم‌زدن اختلاف پتانسیل غشا، باعث فعال شدن بخشی وسیعی از کانال‌های یونی حساس به ولتاژ سدیم در مکان مشخصی (نقطه الف در شکل ٣) از سلول شوند. با بازشدن کانال‌های یونی سدیم، حجم زیادی از یون‌های سدیم وارد سلول شده و همین جابه‌جایی یون‌ها باعث ایجاد اخلاف پتانسیل جدید و فعال شدن کانال‌های سدیمی اطراف ناحیه الف می‌شود. به این ترتیب کانال‌های سدیم نواحی کناری فعال شده و اختلاف پتانسیل نواحی کناری نیز برهم می‌خورد. بعد از آن‌که کانال‌های سدیمی باز شدند و اختلاف پتانسیل اطراف غشأ را از حالت پتانسیل استراحت خارج کردند، شرایط پتانسیلی سلول را به نقطه‌ای می‌رسانند که کانال‌های پتاسیم حساس به ولتاژ باز شده و حجم قابل توجهی از یون‌های پتاسیم از درون سلول خارج شوند. به این ترتیب سلول دوباره به وضعیت اول خود (از نظر اختلاف پتانسیل) باز می‌گردد و همین روند برای نواحی کناری تکرار می‌شود. این سازوکار باعث می‌شود تا چرخه تغییرات پتاسیل در مسیرهای مختلف سلول عصبی (برای مثال در امتداد آکسون) حرکت کند. به این توالی تغییرات پتانسیل در امتداد آکسون و سایر قسمت های سلول عصبی پتانسیل عمل گویند. شکل ٣ نمایی از انتشار پتانسیل عمل (Action potential) در دو زمان مختلف را نشان می‌دهد. تحریک‌های کوچکی از طریق محیط بیرون و یا سلول‌های عصبی دیگر به نورون مقصد اعمال می‌شود. هر کدام از این تحریک‌ها به اختلاف پتاسیل‌های کوچک مثبت و منفی در اطراف غشاء سلول تبدیل می‌شود. اگر این اختلاف پتانسیل‌های کوچک، در زمان و مکان‌های مناسبی اعمال شوند می‌توانند با رسیدن به حد آستانه و برهم زدن اختلاف پتانسیل غشا، باعث فعال شدن بخشی وسیعی از کانال‌های یونی حساس به ولتاژ سدیم در مکان مشخصی (نقطه الف در شکل ٣) از سلول شوند. با بازشدن کانال‌های یونی سدیم، حجم زیادی از یون‌های سدیم وارد سلول شده و همین جابه‌جایی یون‌ها باعث ایجاد اختلاف پتانسیل جدید و فعال شدن کانال‌های سدیمی اطراف ناحیه الف می‌شود. به این ترتیب کانال‌های سدیم نواحی کناری فعال شده و اختلاف پتانسیل نواحی کناری نیز برهم می‌خورد. بعد از آن‌که کانال‌های سدیمی باز شدند و اختلاف پتانسیل اطراف غشأ را از حالت پتانسیل استراحت خارج کردند، شرایط پتانسیلی سلول را به نقطه‌ای می‌رسانند که کانال‌های پتاسیم حساس به ولتاژ باز شده و حجم قابل توجهی از یون‌های پتاسیم از درون سلول خارج شوند. به این ترتیب سلول دوباره به‌وضعیت اول خود (از نظر اختلاف پتانسیل) باز می‌گردد و همین روند برای نواحی کناری تکرار می‌شود. این سازوکار باعث می‌شود تا چرخه تغییرات پتاسیل در مسیرهای مختلف سلول عصبی (برای مثال در امتداد آکسون) حرکت کند. به این توالی تغییرات پتانسیل در امتداد آکسون و سایر قسمت‌های سلول عصبی پتانسیل عمل گویند. شکل ٣ نمایی از انتشار پتانسیل عمل (Action potential) در دو زمان مختلف را نشان می‌دهد.

شکل ٣ - نمایی از انتشار پتانسیل عمل در دو زمان مختلف. پتانسیل عمل از نقطه الف به نقطه ج انتشار می‌یابد.

به این ترتیب هر نورون به‌علت ویژگی‌های غشای تحریک پذیرش، می‌تواند اختلاف پتانسیل‌های متفاوتی تولید کند. اگر این اختلاف پتانسیل‌های به حد آستانه‌ای برسد، پتانسیل عمل تولید شده و در حجم زیادی انتشار می‌یابد. در غیر این صورت، پتاسیل‌های کوچک زیر آستانه با سرعت زیادی از بین رفته و سلول به‌حالت استراحت باز می‌گردد.

زمانی که پتاسیل عمل به انتهای یک سلول رسید؛ چرخه پیچیده‌ای از فعالیت‌های شیمیایی را فعال می‌کند. این فعالیت‌های شیمیایی منجر به آزاد شدن مواد شیمیایی با عنوان «انتقال‌ دهنده‌های عصبی» و یا «میانجی» می‌شود (neurotransmitter). فضای بین دو نورون (محل فعالیت انتقال دهند‌ه‌های عصبی) را سیناپس گویند (شکل ۴). انتقال‌دهنده‌ها از پایانه آکسونی سلول عصبی خارج می‌شوند. این مواد باعث تحریک الکتریکی و ایجاد پتانسیل زیر آستانه بر روی دندریت نورون مجاور می‌شوند. این تحریک‌ها در صورت رسیدن به‌حد آستانه در سلول عصبی مجاور پتانسیل عمل تولید می‌کند. به این ترتیب سیگنال‌های عصبی از یک سلول به کمک فرآیندهای الکتریکی-شیمیایی به سلول دیگر منتقل می‌شود.

شکل ۴ - نمایی کلی از سیناپس و محل آزاد شدن انتقال دهنده‌های عصبی (میانجی‌ها)

پس هر سلول عصبی شامل ویژگی‌های الکتریکی است. این ویژگی‌ها باعث می‌شود تا الگوی مشخصی از اختلاف پتانسیل الکتریکی در اطراف هر سلول ایجاد شود. زمانی که تعدادی از سلول‌ها کنار یکدیگر قرار می‌گیرند، الگوی پتانسیلی جدیدی که از برهم‌کنش رفتار الکتریکی مجموع سلول‌هاست به وجود می‌آید. رفتارهای الکتریکی سلول‌های عصبی همان چیزی است که ما از آن به‌عنوان سیگنال‌های عصبی یاد می‌کنیم. سیگنال‌های عصبی، روند تغییرات اختلاف پتاسیل مربوط به فعالیت‌ نورون‌ها در زمان است. سیگنال‌های عصبی در سطح تک سلول و یا جمعیتی از سلول‌ها مورد مطالعه قرار می‌گیرد. روش‌های ثبت فعالیت‌های عصبی به‌دنبال ثبت و ذخیره‌سازی این نوع سیگنال‌های الکتریکی است. ثبت فعالیت الکتریکی سیستم عصبی در سطوح مختلفی قابل بررسی است. گاهی ما به‌دنبال بررسی رفتار الکتریکی یک تک کانال هستیم و گاهی نیز به مجموع فعالیت الکتریکی میلیاردها سلول نگاه می‌کنیم.

گاهی برای ثبت از سلول‌های عصبی، آن‌ها را از بدن موجود زنده خارج کرده و در وسایل آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می‌دهیم. به این‌گونه روش‌ها که مطالعه بافت، درون وسایل آزمایشگاهی صورت می‌گیرد، روش این‌ویترو (in-vitro) گویند. اما گاهی فعالیت سلول‌های عصبی بدون جدا شدن از بدن موجود زنده، اندازه گیری می‌شود. برای مثال فعالیت عصبی نورون‌های قسمت خاصی از مغز میمون در حالی که یک فعالیت شناختی را انجام می‌دهد اندازه‌گیری می‌شود. به این نوع روش‌ها که بافت از بدن موجد زنده جدا نمی‌شود، روش این‌ویوو (in-vivo) گویند.

    الف) ثبت فعالیت الکتریکی سلو‌ل‌های عصبی جدا شده از موجود زنده:

معروف‌ترین روش برای این نوع از ثبت فعالیت الکتریکی، روشی موسوم به پچ‌کلمپ (Patch clamp) است. در این روش، سلول عصبی را از موجود زنده جدا کرده و در محیط آزمایشگاهی زنده نگه می‌دارند. بعد به کمک یک پیپت شیشه‌ای بسیار ظریف به سلول عصبی نزدیک شده و از طریق نقطه اتصال پیپت شیشه‌ای به مطالعه رفتارهای الکتریکی سلول می‌پردازند (شکل ۵). متناسب با نوع اتصال پیپت شیشه‌ای به غشای سلول‌های عصبی، روش‌های مختلفی برای بررسی رفتار نورون‌ها به وجود ‌می‌آید. در ابتدا پیپت شیشه‌ای به کمک مکش ضعیفی به طور کامل به سلول عصبی چسبیده می‌شود (شکل ٦). در مرحله بعد اگر به کمک یک مکش شدید، غشا سلول پاره شود (شکل ٧)؛ ما از طریق پیپت شیشه‌ای به تمام سلول دسترسی پیدا می‌کنیم و به این ترتیب امکان ثبت از ویژگی‌های الکتریکی درون سلول را به‌دست می‌آوریم.

شکل ۵ - فرآیند پچ‌کلمپ از نورون واقعی
شکل ٦ - چسبیدن کامل پیپت شیشه‌ای به نورون
شکل ٧ - حالتی که تمام سلول مورد مطالعه قرار می‌گیرد

اگر بعد از اتصال پیپت شیشه‌ای، پیپت را به سمت بالا بکشیم، می‌توانی به محیط داخل سلولی قسمتی از نورون دست پیدا کنیم به این روش به اصطلاح داخل-خارج (inside-out) گویند. به کمک این روش می‌توانیم ویژگی‌های الکتریکی قسمتی از محیط داخل سلولی نورون را مورد برسی قرار دهیم. (شکل ٨)

شکل ٨ - نمایی از حالت داخل-خارج در روش پچ‌کلمپ.

حال اگر بعد از اتصال پیپت شیشه‌ای و پاره شدن سلول عصبی، پیپت شیشه‌ای را جدا کنیم؛ می‌توانیم به بخش خارجی قسمتی از سلول دسترسی داشته باشیم. به این روش به اصطلاح روش خارج-خارج (Outside-out) گوییم. (شکل ۹). بعد از جدا شدن تکه‌ای از سلول که قبلا پاره شده است (شکل میانی شکل ۹) به دلیل ویژگی‌های غشای سلولی، دو طرف پاره شده به یکدیگر متصل می‌شوند.

شکل ۹ - نمایی از حالت خارج-خارج در روش پچ‌کلمپ

بعد از دسترسی به قسمت‌های مختلف یک سلول عصبی از طریق روش پچ‌کلمپ، ویژگی‌های الکتریکی آن قسمت از سلول را مورد بررسی قرار می‌دهیم. برای ثبت فعالیت الکتریکی، از الکترود و تقویت کننده استفاده می‌کنیم. الکترودها میدان الکتریکی ناشی از اختلاف پتانسیل ایجاد شده توسط یون‌ها را اندازه می‌گیرد و تقویت کننده این اختلاف پتانسیل بسیار کوچک را چندین هزار برابر تقویت می‌کند. ویژگی‌های الکتریکی نورون‌ها معمولا توسط مؤلفه‌های مداری مانند مقاومت و خازن توصیف می‌شود (شکل ۱٠). هر قسمتی از غشأ، مقاومتی در برابر عبور جریان دارد و به‌دلیل عدم تقارن یون‌ها در دو طرف آن خواص خازنی نیز نشان می‌دهد. این نوع نگاه در مدل‌سازی ریاضی سلول‌های عصبی که اولین بار توسط دو دانشمند به نام‌های Hodgkin و Huxley بیان شد، نیز کمک بسیار زیادی به ما می‌کند. در روش پچ‌کلمپ می‌توان جریان و اختلاف پتانسیل قسمت مورد مطالعه سلول را اندازه‌گیری کرد. این کار گاهی با ثابت نگه داشتن جریان و گاهی با ثابت نگه داشتن ولتاژ انجام می‌شود.

شکل ۱٠ - توصیف سلول عصبی به کمک مولفه‌های مداری مقاومت و خازن. دایره‌‌ی نشان‌دهنده یک نورون کروی است که یک الکترود مخروطی در حال ثبت گرفتن از آن است.

به این ترتیب فعالیت الکتریکی در سطح تک سلول‌ ثبت می‌شود. شناسایی ویژگی‌های الکتریکی قسمت‌های مختلف سلول‌های عصبی به ما کمک می‌کند تا بتوانیم توصیف دقیق‌تری از ارتباط و تعامل نورون‌ها در شبکه‌های بزرگ سیستم عصبی، پیدا کنیم.

    ب) ثبت فعالیت الکتریکی سلو‌ل‌های عصبی، درون موجودات زنده:

برای پیدا کردن رابطه رفتار و فعالیت‌های عصبی، ما نیازمند آن هستیم که از فعالیت نورون‌ها، هنگام انجام فعالیت شناختی ثبت بگیریم. برای این‌کار نیازمند مقدمات زیادی هستیم. گاهی فرآیند ثبت بر روی موجود بیهوش انجام می‌شود. هرچند بیهوشی فرآیند ثبت را آسان می‌کند اما محدودیت بسیار بزرگی بر رفتار و فعالیت‌های شناختی اعمال می‌کند. از این‌رو، بیشتر دانشمندان حوزه علوم اعصاب شناختی از فعالیت عصبی موجودات زنده در حالت هوشیار ثبت می‌گیرند.

چون امکان دسترسی به درون سلول‌های عصبی موجودات زنده بسیار دشوار است، معمولاً از فرآیند ثبت خارج سلولی برای این منظور استفاده می‌شود. در این روش الکترود در میان فضای بین سلولی قرار می‌گیرد (شکل ۱۱). به این ترتیب، برآیند فعالیت عصبی همه سلول‌های اطراف الکترود اندازه‌گیری خواهد شد. علاوه بر ماهیت ترکیبی سیگنال‌های دریافت شده؛ اختلاف پتانسیل‌هایی که در محیط خارج سلولی احساس می‌شود، بسیار ضعیف‌تر از پتانسیل‌های درون سلولی است. از این‌رو ما نیازمند ابزار اندازه‌گیری دقیق‌تری برای ثبت هستیم.

شکل ۱۱ - الکترودی که در فضای بین سلول‌های عصبی قرار گرفته است.

سیگنال به‌دست آمده از روش ثبت خارج سلولی، بیانگر فعالیت تعداد بسیار زیادی از نورون‌هاست. الگوریتم‌های شناسایی الگو برای تفکیک پاسخ‌های مختلف سیگنال خارج سلولی به‌کار گرفته می‌شود. الگوی ویژه پاسخ سلول‌های عصبی امکان جداسازی فعالیت تک سلول‌ها از سیگنال به‌دست آمده را فراهم می‌کند. فعالیت چند نورون اطراف الکترود در پهنای باند ٣٠٠ تا ٣٠٠٠٠ هرتز یافت می‌شود. فعالیت‌های عصبی نرون‌های دور دست معمولا زیر آستانه پتانسیل عمل در پهنای باند زیر ٣٠٠ هرتز قرار می‌گیرند.

به این ترتیب در نتیجه جریان ثبت خارج از سلولی ما به سیگنال پیچیده‌ای می‌رسیم که معرف سطوح مختلف فعالیت‌های عصبی همراه یک عمل شناختی است. برای مثال شکل ۱٢ میمونی را نشان می‌دهد که در حال انجام عمل شناختی دیدن است و هم‌زمان با این عمل از سلول‌های عصبی مغزش، ثبت گرفته می‌شود. در مطالعات قبلی مشخص شده که کدام قسمت از مغز میمون مربوط به پردازش ورودی‌های بینایی است. با عمل‌جراحی وسایل لازم برای رساندن الکترود به آن نقطه خاص از مغز میمون نصب می‌شود. به این ترتیب دنیای درون مغز موجود زنده با معیارهای اندازه پذیرِ، در دست انسان امروز است.

شکل ۱٢ - الکترودها به‌صورت همزمان با فعالیت شناختی بینایی، فعالیت نورون‌های میمون را ثبت می‌کنند.


[] يادداشت‌ها




[] پی‌نوشت‌ها

ابوالقاسمی دهاقانی، محمدرضا، مروری بر روش‌های مطالعه شناخت (قسمت دوم)، ماهنامۀ دانشمند، سال پنجاه‌ويكم، شماره ۱٠ (پياپی ٦٠۳)، دی ۱۳۹٢، صص ٨٧-۹٠.


[] جُستارهای وابسته




[] سرچشمه‌ها

ماهنامۀ دانشمند، سال پنجاه‌ويكم، شماره ۱٠ (پياپی ٦٠۳)، دی ۱۳۹٢؛ و نیز رجوع شود به از عصب تا ذهن، وبلاگ محمدرضا ابوالقاسمی دهاقانی؛ برگرفته از منابع زیر:

□ Dr. Sophie Veitinger, “The Patch-Clamp Technique”, Science Lab, November 09, 2011.
□ Martin, A. Robert, Bruce G. Wallace, and Paul A. Fuchs. From neuron to brain. Vol. 271. Sunderland, MA: Sinauer Associates, 2001.
□ Bear, Mark F., Barry W. Connors, and Michael A. Paradiso, eds. Neuroscience Exploring the Brain. Wolters Kluwer Health, 2007.
□ Binder, Marc D., and Nobutaka Hirokawa. Encyclopedia of neuroscience. Springer, 2009
□ http://www.ccs.fau.edu/~dawei/COG/Problem/q03.html
□ شکل ۴ و ٦ از منبع شماره ٣ و شکل ٧ و ٨ و ۹ از منبع شماره ۱ و شکل ۱٢ از منبع شماره ۵ آمده است. بقیه عکس‌ها از جستجوی گوگل با کمی تغییرات آمده است.